PCR Aşamaları Temel Veteriner Genetik
PCR’ın ilk aşamasında kalıp DNA’nın birkaç dakika süresince 90 °C’de tutularak zincirlerin birbirinden ayrılması gerekmektedir. Bu işlem karşılıklı zincirler arasındaki hidrojen bağlarının kırılmasını sağlamaktadır ve denatürasyon adı verilmektedir. Tek zincirli hale getirme işleminin ardından sıcaklık 50-60 °C civarına düşürülerek, primerlerin kalıp DNA üzerindeki komplementer dizilerine bağlanması sağlanmaktadır (Şekil 10.1). Bu aşama da bağlanma- annealing aşaması olarak isimlendirilmektedir. Sonraki aşamada ise ısıya dirençli polimeraz enzimi primerlerin 3’ ucundan başlayarak yeni bir DNA sentezlemektedir (Şekil 10.2). Bu aşamaya uzama (elongation) adı verilmektedir. Uzama 70°C’de olmaktadır ve enzim bir primerin varlığına ihtiyaç duymaktadır. Ayrıca burada unutulmaması gereken bir diğer önemli konu da uzamanın sadece 5’-3’ yönünde olduğudur. Polimeraz enzimi kalıp DNA’yı 3’-5’ yönünde okur ama komplementerini 5’-3’ yönünde sentezler.
Üç aşama sonunda, bir kalıp DNA’daki hedef bölgenin ikiye katlanması sağlanmaktadır. Bu üç farklı sıcaklığın arka arkaya olması bir döngü adını almaktadır ve her döngü sonunda 2’nin katları şeklinde logaritmik bir artış olmaktadır. Bu artış, n döngü sayısı olarak kabul edilirse 2n şeklinde hesaplanabilir (Şekil 10.3)
PCR ürünleri genellikle jel elektroforezi yoluyla görüntülenmektedir. Jel elektroforezi, DNA, RNA ve protein gibi biyolojik makromoleküllerin, elektriksel bir alanda, katı bir ortamda molekül ağırlıkları ve sahip oldukları elektrik yüküne göre göç etmeleri prensibine dayanmaktadır. Moleküllerin yük ve ağırlıklarına göre katettikleri mesafe de farklı olmaktadır. Diğer bir deyişle, düşük ağırlıklı moleküller ya da az baz çifti içerenler hızlı hareket ederken, büyük moleküller daha yavaş hareket etmektedirler. Elektroforez işleminde elektrik akımını ileten bir tampon sıvı, katı ortam oluşturmak için kağıt, selüloz asetat, nişasta, agaroz veya poliakrilamid ile doğru akım üretmek için bir güç kaynağı gerekmektedir. Jel elektroforezinde, katı alan oluşturmak amacıyla çok farklı kimyasallar kullanılmakla birlikte sıklıkla akrilamid ve kırmızı algden üretilen agaroz tercih edilmektedir. Bu kimyasalların polimerizasyonu sırasında por adı verilen gözle görülemeyen gözenekler oluşmaktadır.
Akrilamidin polimerize olması temeline dayanan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) daha çok proteinlerin ve 500 baz çiftine kadar DNA’ların ayrımında kullanılabilmektedir. Ancak DNA ve RNA çalışmalarında daha çok agaroz jel elektroforezi tercih edilmektedir. Agaroz jel, elektroforez tamponu içerisine konulan agarozun yüksek sıcaklıkta eritilmesi ve ardından 45-50 °C’ye kadar soğutularak jel kasedi içerisine dökülmesi ile hazırlanmaktadır. Kuyucukların oluşması için eriyen jel içerisine taraklar yerleştirilerek oda sıcaklığında dondurulmaktadır. Jel donduktan sonra taraklar çıkartılarak oluşturulan kuyucuklara DNA veya PCR örnekleri yüklenerek, güç kaynağı yardımıyla doğru akım verilmektedir. Eksi yüklü olan DNA molekülleri anottan katoda doğru hareket ettikleri ve küçük moleküller daha hızlı gittiği için örnekler arası ayrım yapılabilmektedir (Şekil 10.4).
Polimeraz Zincir Reaksiyonunun laboratuarlar tarafından kabul görmesi ve yaygın bir şekilde kullanılmaya başlamasının ardından PCR’a dayanan ve hayvancılık çalışmalarında belirteç olarak kullanılan yeni teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerin en sık kullanılanları şunlardır: Kesilmiş parçacık uzunluk polimorfizmi (restriction fragment length polymorphism, RFLP): PCR-RFLP tekniği DNA üzerindeki varyasyonlara dayanmaktadır. İstenilen bölgenin PCR’ının ardından restriksiyon endonükleaz enzimleri kullanılarak DNA’nın parçalara ayrılması prensibine dayanmaktadır. Enzimin tanıdığı ve kesim yaptığı bölgedeki baz farklılıklarına göre de kesilip kesilmemeye bağlı olarak farklı uzunlukta DNA parçaları elde edilmektedir. Kesilmiş parçacıkların ayrımı da yine jel elektroforezi yoluyla yapılmaktadır. Her enzimin kendine özgü bir tanıma dizisi vardır (Tablo 10.1). Kesim sonrasında DNA’nın açıkta kalan uçları aynı noktadan karşılıklı kesiliyorsa kör; en az bir baz farklılıkla kesiliyorsa yapışkan uçlar oluşmaktadır.
Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi (amplified fragment length polymorphism, AFLP): Bu teknik üç aşamayı kapsamaktadır. Bunlar; DNA’nın restriksiyon enzimleriyle kesilmesi ve bunu takiben kesilen uçlara özgül dizilerin eklenmesi; bu parçaların PCR ile çoğaltılması ve çoğaltılan parçaların görüntülenmesidir (Şekil 10.5). Teknik değişken sayılı bitişik tekrar (variable number tandem repeat, VNTR) polimorfizmlerine dayalı alellerin ayrımını sağlamaktadır. Az sayıda tekrar içerenler hızlı, çok sayıda tekrar içerenler yavaş hareket etmektedirler. Polimorfik DNA’nın rastgele çoğaltılması (random amplified polymorphic dna, RAPD): Bu teknik, yaklaşık 10 nükleotid uzunluğunda çok sayıda primer kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin PCR yoluyla çoğaltılması ve görüntülenmesine dayanmaktadır. Mikrosatellit analizleri: Mikrosatellit terimi, genomda dağılmış olarak bulunan 2-6 baz çiftinin değişken sayıda tekrarını ifade etmektedir. Genomdaki ikili tekrarların mikrosatellit kabul edilebilmesi için en az 7 tekrar olması gerekmektedir. Mikrosatellitlere kısa ardışık tekrarlar (short tandem repeat, STR) ya da basit dizi tekrarları (simple sequence repeat, SSR) denilmektedir. Örneğin bir allelde GC ikili tekrarı 7 kere bulunurken, bir başka allelde 13 kere bulunabilmektedir ve bu farklılıktan yararlanılarak örnekler arası polimorfizm PCR yardımıyla ortaya konulabilmektedir (Şekil 10.5).
Hayvanlarla ilgili çalışmalarda en sık kullanılan belirteçlerden birisi olan mikrosatellitler, eşbaskın (ko-dominant) kalıtım göstermektedirler. Bu yüzden özellikle ebeveyn belirleme testlerinde, adli olaylarda ve populasyon çalışmalarında sıklıkla tercih edilmektedirler. Tercih edilmelerinin başlıca nedeni ise farklı sayıdaki tekrarlara bağlı olarak allelin baz sayısının değişiklik göstermesi ve buna bağlı olarak da polimorfizmin yüksek olmasıdır. Tekli nükleotit polimorfizmi (TNP; single nucleotide polymorphism, SNP): Genom üzerinde belirli bölgelerde bireyler arasındaki tek bazlık farklılığa dayanan (A,T, G ya da C) polimorfizm türüdür. Bu tek bazlık farklılıklar, bazı hayvanların farklı görünmesinin, bazı hayvanların hastalıklara dirençli olmasının ya da davranış farklılıkları olmasının sebebi olabilmektedir. Genomun herhangi bir bölgesinde olabilirler ve sayıları her 1000-1500 baz da bir olacak şekilde 2-3 milyon arasıdır. Eşbaskın belirteçlerden SNP’ler çeşitli amaçlar için kullanılabilmektedir. Eğer daha önceden bir hastalıkla ya da fenotiple ilişkilendirilmiş olan tek bir SNP’e bakılacaksa ve enzim tanıma bölgesinde değişikliğe neden oluyorsa RFLP ile örnekleri taramak yeterli olmaktadır.
Örneğin 9. Bölümde anlatılan BLAD hastalığında, CD18 glikoproteinini kodlayan genin 383. nükleotidinde A/G değişimi bir SNP’tir ve TaqI adı verilen bir restriksiyon enzimi için kesim bölgesi oluşturmaktadır. Ancak genom düzeyinde bir hastalıkla ya da fenotiple ilgili gen veya genlerin yerleri belirlenmek isteniyorsa, ya da ebeveyn testi gibi birden fazla bölgenin karşılaştırılması gerekiyorsa çok sayıda SNP bölgesini tarayıp ilişkilendirmek gerekmektedir. Sayıları milyonlarla ifade edilen SNP’lerin analizleri mikroarray teknolojisiyle yapılmaktadır. Mikroarray, cam, plastik gibi küçük katı bir yüzey üzerine çok sayıda probun belirli noktalara mikroskobik düzeyde tutturulmasıyla elde edilmektedir (Şekil 10.6). Bu noktalara spot adı verilmektedir ve mikroarray üzerinde binlerce bulunmaktadır. İlgili SNP’in hangi allelinin spotlara bağlandığına göre analiz görüntüsü değişmekte ve böylece bir seferde binlerce SNP alleli okunabilmektedir. SNP’ler kolay belirlenebildikleri ve düşük mutasyon oranına sahip oldukları için özellikle insanlarda en fazla tercih edilen moleküler belirteçlerdir ve her geçen gün hayvanlarda belirlenen SNP sayısı da katlanarak artmaktadır. Kanatlılarda 2004 yılına kadar 2,8 milyon, köpekte 2005 yılına kadar 2,5 milyon ve sığırda da 2 milyon SNP belirlenmiş ve yayınlanmıştır ve domuz için de böyle bir panel beklenmektedir. Genom dizilimleri çıkartılan hayvan sayısı arttıkça, ticari olarak ulaşılabilen SNP mikroarray kitleri de artmaktadır.
Dizi analizi: DNA dizi analizi bir DNA parçasının sahip olduğu tüm baz dizilimini ortaya koyduğu için, diğer tekniklere oranla, bireylerin ya da populasyonların farklılaşmasında rol oynayan mutasyonları da daha net bir şekilde ortaya koyabilmektedir. DNA dizi analizi iki metotla yapılabilmektedir. Bunlardan birisi Maxam ve Gilbert’in 1977 yılında yayınladıkları kimyasal kırılma yöntemidir. Bu metot baz-spesifik- kimyasallar yardımıyla, DNA’da yer alan bazı nükleotit bölgelerinde şeker- fosfat iskeletinde rastgele kırılmalar oluşturulmasına dayanmaktadır. Bu amaçla hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asit kullanılarak bazlar değişikliğe uğratılmakta ve daha sonra piperidin yardımıyla degişikliğe uğramış nükleotitlerin bulunduğu noktalardan DNA zinciri kırılmaktadır. Bu yöntemde, nükleotit dizisi saptanacak olan DNA önce 5’ ucundan radyoaktif bir madde ile işaretlenmektedir. Daha sonra DNA’nın ayrı ayrı A, C, G ya da T nükleotitlerinden kırılması için dört ayrı tüpte değişime uğrama ve kırılma tepkimeleri gerçekleştirilmekte ve böylece her tüpte farklı nükleotitlerden kırılmış boyları birbirinden farklı DNA parçaları elde edilmektedir. Elde edilen DNA parçacıkları, yüksek çözünürlükte poliakrilamid jel elektroforezi ile küçükten büyüğe doğru ilerleyerek birbirlerinden ayrılmakta ve DNA bantları görünür hale getirilmektedir. Zararlı kimyasalların kullanıldığı bu yöntem bir tepkimede en fazla 100 baz okumasıyla sınırlı kalmaktadır. Bir diğer ve daha sık kullanılan dizi analizi tekniği ise 1977’de Sanger ve arkadaşları tarafından geliştirilen dideoksi dizi sonlandırma (chain termination) reaksiyonudur. Bu teknik, dNTP’lerin yanı sıra 3’-hidroksil (OH-) grubu olmayan 2’,3’-dideoksiribonükleozit trifosfatların (ddNTP) ve DNA Polimeraz enziminin yardımıyla DNA moleküllerinin 5’”3’ yönünde uzatılmasına dayanmaktadır. Reaksiyon sırasında DNA polimeraz tarafından sentezlenen PZR ürününe herhangi bir ddNTP’nin katılması ile 3’ pozisyonunda serbest hidroksil grubu olmadığından yeni bir baz eklenemez ve sentez devam etmez (Şekil 10.7). Bunun sonucu olarak da serbest Hidroksil grubu olmayan A,G,T ve C bazlarına bağlı olarak değişen boylarda PZR ürünleri oluşmaktadır.
Sanger ve arkadaşları tarafından geliştirilen metotda kalıp DNA, bir primer, DNA polimeraz, üç işaretlenmemiş dNTP, bir işaretli dNTP ve işaretli dNTP’nin ddNTP formunu içeren 4 ayrı tüp içerisinde (A tüpü, G tüpü vb.) dört ayrı PZR reaksiyonu kurulmaktadır. Reaksiyonda primer tek zincirli DNA kalıbına bağlanıp, ddNTP formdaki baz eklenene kadar tek bir baz yönünden işaretli halde uzamaktadır. PZR ürünlerinin büyüklüğünün belirlenmesi, yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezinde yapılmaktadır. Elektroforezde en hızlı giden band en küçük DNA fragmentidir ve hangi ddNTP ile oluşturulmuş ise primerden sonra gelen ilk baz odur. Hızı ilk banta en yakın olan ikinci bant ise ikinci bazı göstermektedir. Böylece aşağıdan yukarıya doğru hızı giderek düşen, baz uzunluğu ise giderek artan bantların hangi ddNTP ile oluşturuldukları belirlenmekte ve 5’-3’ yönüne doğru olan baz dizilimi okunmaktadır Daha sonraki yıllarda geliştirilen ve artık daha yaygın kullanılan dideoksi metodunda ise tek tüp içinde dört dNTP’de reaksiyona katılmakta ve farklı renk floresan boyayla işaretlenmiş ddNTP’ler de reaksiyona girmektedirler. Floresan işaretli ddNTP’ler kapiller elektroforez cihazlarında bulunan özel algılayıcılarla tanınıp her bir baz farklı renkte pik verecek şekilde görsel olarak kaydedilmekte ve böylece hassas bir şekilde dizileme yapılabilmektedir (Şekil 10.8). Elde edilen diziler alt alta hizalanarak incelenmekte ve mutasyon olan baz dizilimleri net bir şekilde gözlenebilmektedir.