Temel Veteriner Genetik Ünite 10 Özet
Polimeraz Zincir Reaksiyonu’nun (PCR) tanımını yapabilmek ve aşamalarını açıklamak
PCR genom üzerinde seçilen bir DNA bölgesinin in-vitro olarak çoğaltılması demektir. PCR ile çok az miktarlardaki DNA molekülü, kısa bir süre içinde yüksek miktarlara çıkartılmaktadır. PCR için gerekli olanlar; kalıp DNA, ileri ve geri yönlü bir çift primer, ısıya dayanıklı DNA polimeraz enzimi, serbest nükleotidler ve termal döngü cihazıdır. PCR, kalıp DNA’nın karşılıklı zincirleri arasındaki hidrojen bağlarının kırılmasını sağlayan denatürasyon; primerlerin kalıp DNA üzerindeki komplementer dizilerine bağlanması sağlayan bağlanma; polimeraz enziminin yeni bir DNA senezlemesini kapsayan uzama aşamalarından oluşmaktadır. Bu aşamaların arka arkaya olması bir döngü adını almaktadır. PCR ürünleri genellikle jel elektroforezi yoluyla görüntülenmektedir. Jel elektroforezi, DNA, RNA ve protein gibi biyolojik makromoleküllerin, elektriksel bir alanda, katı bir ortamda molekül ağırlıkları ve sahip oldukları elektrik yüküne göre göç etmeleri prensibine dayanmaktadır.
PCR’a dayanan bazı temel moleküler teknikleri açıklamak
PCR’ın yaygın bir şekilde kullanılmaya başlamasının ardından PCR’a dayanan ve hayvancılık çalışmalarında belirteç olarak kullanılan yeni teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerin en sık kullanılanları RFLP, AFLP, RAPD, Mikrosatellit ve SNP’lerdir. Bu tekniklerin ortak özelliği polimorfizme dayanmalarıdır. PCR-RFLP tekniği istenilen bölgenin PCR’ının ardından restriksiyon endonükleaz enzimleri kullanılarak DNA’nın parçalara ayrılması prensibine dayanmaktadır. Enzimin tanıdığı ve kesim yaptığı bölgedeki baz farklılıklarına göre de kesilip kesilmemeye bağlı olarak farklı uzunlukta DNA parçaları elde edilmektedir. AFLP tekniği, DNA’nın restriksiyon enzimleriyle kesilmesi; kesilen uçlara özgül dizilerin eklenmesi; bu parçaların PCR ile çoğaltılması ve çoğaltılan parçaların görüntülenmesine dayanmaktadır. RAPD tekniği, yaklaşık 10 nükleotid uzunluğunda çok sayıda primer kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin PCR yoluyla çoğaltılması ve görüntülenmesine dayanmaktadır. Kısa ardışık tekrarlar, basit dizi tekrarları gibi adlandırmaları da kullanılan mikrosatellitler ise, genomda dağılmış olarak bulunan 2-6 baz çiftinin değişken sayıda tekrarını ifade etmektedir. Bireyler arası değişen tekrar sayılarından yararlanılarak örnekler arası polimorfizm PCR yardımıyla ortaya konulabilmektedir. SNP’ler ise genom üzerinde belirli bölgelerde bireyler arasındaki tek bazlık farklılığa dayanan (A,T, G ya da C) polimorfizm türüdür. Ayrıca birçok alanda yaygın olarak kullanılan DNA dizi analizi de önemli bir tekniktir. Çeşitli teknikler önerilmekle beraber, son yıllarda en çok kullanılanı Sanger ve arkadaşlarının dizi sonlanma reaksiyonudur. Bu teknikte PCR işlemi sırasında, normal deoksi nükleotidlere ek olarak dideoksi nükleotidler de kullanılmaktadır ve bu nükleotidler raslantısal olarak diziye eklendiğinde, serbest OH bölgesi olmadığı için, dizi sonlanmaktadır. Bu şekilde yüzlerce farklı uzunlukta PCR ürünleri oluşmakta, alt alta okunduklarında da istenilen bölgenin DNA dizilimi elde edilebilmektedir.
Veteriner Genetikte moleküler tekniklerin kullanımalanlarını yorumlamak
Veteriner genetik alanında moleküler teknikler giderek daha fazla kullanım alanı bulmaya başlamıştır. Belirteç Yardımcılı Seleksiyon (Marker Assisted Selection, MAS), rekombinant DNA teknolojisi, transgenik hayvan üretimi, kalıtsal hastalıkların mekanizmalarının belirlenmesi ve taranması, filogenetik çalışmalar ve adli olay çalışmaları bunların başlıcalarıdır. Çevre etkisinin genotipik varyasyon üzerinde büyük payı olduğu karakterlerde yani kalıtım derecesi düşük karakterlerde fenotipe bakarak seleksiyon yapmak hem hatalı hem de zor olmaktadır. Böyle durumlarda, moleküler genetik ile fenotipik verilere dayanan seleksiyonun, diğer bir deyişle belirteç yardımcılı seleksiyonun beraber kullanılması, etkinliği ve doğruluğu arttırmaktadır. Belirteç Yardımcılı Seleksiyon’da, DNA belirteçleri kantitatif karakterleri kodlayan genlerin yer aldığı kromozom bölgelerini işaret etmektedirler. Bu kromozomal bölgelere Kantitatif Karakter Lokusları (K.K.L; Quantitative Trait Loci, QTL) adı verilmektedir. Çiftlik hayvanlarında belirteçler yardımıyla belirlenmiş birçok QTL bulunmaktadır. Söz konusu karakterlerde klasik ıslah programlarıyla çok uzun süreçler sonucunda elde edilebilecek genetik ilerlemenin, belirteçlerin ya da aday genlerin kullanımı ile bir veya birkaç nesilde elde edilmesi mümkün olmaktadır. Rekombinant DNA (rDNA), teknolojisi bir organizmadan diğerine genetik materyal aktarımını kapsayan, bir dizi işlemler bütünüdür. Rekombinant DNA aktarımı sonucu üretilen proteine rekombinant protein, aktarımın yapıldığı organizmaya ise transgenik organizma adı verilmektedir. Transgenik çiftlik hayvanlarının kullanım amacı ise model olmalarının yanı sıra çok miktarda süt üretebilmeleri ve böylece süt üretimi sırasında çok miktarda da rekombinant protein üretmeleri gibi verim özellikleridir. Bu amaçla kullanılan hayvanlara biyoreaktör hayvanlar adı verilmektedir. Filogenetik çalışmalar, türler arasındaki ilişkileri, ırkların tarihini ve genetik çeşitliliği inceleyen çalışmalardır ve populasyonlar arasındaki fenotipik ve genetik farklılıkların belirlenmesine dayanmaktadırlar. Kalıtsal hastalıklar sonraki nesillere kalıtım yoluyla geçen hastalıklardır. Özellikle ekonomik değeri olan hayvanlarda, homozigot ya da heterozigot, her iki durumda da belirlenmesi ve ilgili mutasyonun eradike edilmesi gerekmektedir. Ayrıca kalıtsal hastalıkların mekanizmalarının ve altında yatan gen bozukluğunun belirlenmesi, benzer hastalıkların insanlarda da olması nedeniyle, ayrı bir öneme de sahiptir. Son yıllarda hayvanlarla ilgili adli olaylarda da moleküler teknikler kullanılmaya başlamıştır. Örneğin bir kan damlasının hangi türe ait olduğu veya bir et ya da kıl örneğinin hangi bireye ait olduğu kolaylıkla belirlenebilmektedir. Bu testlerin temelinde yine polimorfizm yatmaktadır.