Tespit Hataları (artefakt)
Formalin, Bouin, Zenker gibi tespit solüsyonlarının içinde bulunan kimyasala özgü pigment birikimleri, bunlarla tespit edilmiş doku örneklerinde görülebilir. Tespit işlemi hücreleri yaşamdaki şekil ve kimyasal yapılarına yakın olarak korumak olmasına karşın tespit solüsyonunun bizzat kendisi hata oluşturabilir. Bu genellikle patoloji laboratuarlarında sık kullanılan formalin solüsyonunda uzun süre tespit edilen özellikle kandan zengin doku örneklerinin histolojilerinde gözlenir ve patolojik şekillenen pigmentlerden ayırd edilmelidir. Bu amaçla formalin pigmentini uzaklaştırmak için en etkili yol boyanmamış doku kesitlerinin alkolle doyurulmuş pikrik asit uygulamasıyla formalin pigmentini uzaklaştırmaktır.
Sitopatolojide Tespit
Hazırlanan yayma ve tuşe preparatlarda tespit ıslak ya da kuru olabilir. Islak tespit için hazırlanan preparat, çoğunlukla % 96’lık etil alkolde 10 dakika bırakılarak yapılır. Bu tür tespitte antijenik yapılar iyi korunur. Ayrıca metanol ve aseton da tespitte kullanılabilir. Kuru tespitte hazırlanan preparat havada bırakılır ya da elle sallayarak veya fön makinası kullanarak sıcak hava ile tespit hızlandırılır. Kuru tespitte dikkat edilmesi gereken nokta hazırlanan preparatın her tarafının aynı kalınlıkta olmasıdır. Eğer aynı kalınlıkta olmazsa kalın taraf kolay kurumayacak, kolay kuruyan ince tarafta ise yapılarda artefaktlar oluşacaktır.
Elektron Mikroskopide Tespit
Tespit sıvısı olarak birinci tespitte en çok stok solüsyonundan hazırlanmış % 2.5 ‘luk buffer glutaraldehit (% 25 glutaraldehit stok solüsyon 10 ml + 0.1 mol/L kakodilat buffer pH: 7.4) ikinci tespitte ise sulu % 2’lik osmium tetroksit (osmium tetroksit 1.0 gr + distile/deiyonize su 50 ml) kullanılır. Elektron mikroskopta iyi bir tespit için parçanın boyu, solüsyonların yoğunluğu, pH ve ısısı ile tamponun uygunluğu önemlidir. Bu amaçla alınacak doku örneklerinde otolizden kaçınmak için deneysel çalışmalarda mümkünse perfüzyondan hemen sonra alınması ve düz bir camda tespit solüsyonunun içerisinde trimlemesi yapılmalıdır. Tespit sıvılarında pH’nın nötr (7.2-7.4) olması ve doku örneklerinin buzdolabı sıcaklığında (4°C) bırakılması önerilir. Ayrıca parafinde bloklanmış materyallerden de geri dönüş yapılarak elektron mikroskop için kesit alınabilir.
Dekalsifikasyon (kalsiyumsuzlaştırma)
Tespit için alınan örneklerin çoğu yumuşak kıvamlı olduklarından yukarıda açıklanan tespit solüsyonları kullanılmaktadır. Bazı nekropsi ve tümör materyallerinde (özellikle köpek meme tümörleri) veya kıkırdak ve kemik gibi sert dokuların tespit işlemi farklı teknik uygulamaları gerektirir. İlk olarak bu sert dokular içerisinde bulunan kalsiyumun uzaklaştırılarak dokunun yumuşatılması gerekir. Bu işleme ise dekalsifikasyon (kalsiyum uzaklaştırma, kalsiyumsuzlaştırma) denir. Bu amaçla kullanılan kimyasal dekalsifikasyon solüsyonları etkilerini iki yolla yaparlar. İlki çözülebilir kalsiyum tuzları oluşturan asitlerle diğeri ise özellikle kalsiyum ve mağnezyum iyonlarını bağlayan ajanlarla (etilendiamintetraasetik asit=EDTA) yapılır. Asit dekalsifikasyon solüsyonları da güçlü inorganik (hidroklorik, nitrik) ve zayıf organik asitler (formik, asetik ve pikrik) olarak ayrılır. Uygun büyüklüğe getirilen kemik doku laboratuardaki genel tespit solüsyonlarında tespit edildikten sonra amaca yönelik olarak yukarıda belirtilen farklı dekalsifikasyon solüsyonlarına aktarılır. Dekalsifikasyon yapılacak solüsyonun seçimi, işlemin sonucunun hızlı istenip istenmediğine, kapsadığı kalsiyum düzeyine ve istenen boyanma özelliğine göre yapılır. Hayvan türü (köpek, tavuk) ve yaşı (genç, ergin) gibi faktörler de dekalsifikasyon solüsyonunun seçiminde etkilidir. Dokuların boyanma özellikleri kullanılan dekalsifikasyon solüsyonlarının kapsadıkları asite ve dekalsifikasyonun hızlı ya da yavaş oluşuna göre değişmektedir. Dekalsifikasyon esnasında karıştırıcı kullanılması kalsifikasyon süresini hızlandırdığı gibi solüsyonun her yöne eşit dağılmasını sağlar. Eğer yapılamıyorsa mümkün olan kısa sürelerde solüsyon değiştirilmelidir. Dekalsifikasyonun durdurulması için dokunun kontrolü, esnekliğine bakılarak veya toplu iğne batırılarak yapılır. İğne zorlanmadan dokuya batıyorsa dekalsifikasyon tamamlanmış demektir. Şartlar uygunsa röntgeni çekilerek kontrol yapılabilir. Dekalsifikasyon solüsyonu içerisinde dokunun fazla kalması boyanma özelliklerini etkilediğinden kontrollü şekilde yapılan dekalsifikasyon işlemi hızla sonlandırılmalıdır. Sonlandırma ise % 5’lik sodyum sülfatta 2-3 saat bekletilerek yapılır. Daha sonra dokular suda yıkanarak normal işleme geçilir.
Güçlü İnorganik Asitler (hidroklorik asit, nitrik asit): % 5-10’luk yoğunlukta önerilen basit sulu solüsyonları kullanılır. Hızlı dekalsifikasyon oluştururlarsa da doku şişkinliğine ve 24-48 saatten uzun süre solüsyonda kalırlarsa dokuda ciddi yıkıma neden olurlar. Zayıf ve kötü histolojik boyanmaya neden olurlar. Histokimyasal ve immunolojik boyamalar için uygun değildirler. Sulu nitrik asit % 5-10 (Clayden 1952); (nitrik asit 5-10 ml + distile su=toplamı 100ml) – Perenyi’nin solüsyonu (Perenyi 1882); (%10 nitrik asit 40 ml + saf etil alkol 30ml + % 0.5 kromik asit 30 ml) en sık kullanılanlarıdır.
Zayıf Organik Asitler (formik, asetik, pikrik asitler): Formik asit en sık kullanılanıdır. Asetik ve pikrik asitler doku şişmesine neden olur. Hızlı ve küçük kireçlenmeler için uygundur. Sulu formik asit (% 90 stok formik asit 5-10 ml + distile su=toplamı 100 ml) – Buffer formik asit (Evans & Krajian 1930); (% 20 sulu sodyum sitrat 65 ml + % 90 stok formik asit 35 ml) en bilinen dekalsifikasyon solüsyonlarıdır.
Kalsiyum İyonlarını Bağlayan Ajanlar (EDTA): Yavaş işlem hızına sahiptir. Zaman uygun ise mükemmel bir dekalsifikasyon solüsyonudur. Doku yıkımı ve boyanma üzerine olumsuz etkisi yoktur. Formalin EDTA (Hilleman & Lee 1953); (EDTA disodyum tuzu 5.5 gr + distile su 90 ml + % 35-40 stok formaldehit 10 ml) en bilinenidir.