Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Amerikalı Biyokimyacı Karry Banks Mullis tarafından 1983’de Polimeraz Zincir Reaksiyonunun (Polymerase Chain Reaction, PCR/PZR) tanımlanması ve çalışmanın 1987 yılında yayınlanmasının ardından moleküler tekniklere her geçen gün yeni bir teknik eklenmiştir. PCR (PiSiAr şeklinde okunur), DNA dizilerinin in-vitro olarak çoğaltılması demektir. PCR ile çok az miktarlardaki DNA molekülü, kısa bir süre içinde yüksek miktarlara çıkartılmaktadır. Böylece tek bir hücredeki DNA bile klonlanma veya dizisinin çıkartılması işlemi anlamına gelen sekanslama işlemleri için kullanılabilir hale gelmektedir. Bu nedenle de klinik tanı, genetik analizler, gen mühendisliği ve adli analizlerde sıklıkla tercih edilmektedir. PCR tüm bir genom yerine, sadece genom üzerinde seçilen bir DNA bölgesinin çoğaltılmasını sağlamaktadır. Bu işleme yükseltgenme denilmektedir. PCR için gerekli olanlar sırasıyla aşağıda listelenmiştir:
• Kalıp adı verilen DNA molekülünün bulunması gerekir. DNA çok az miktarlarda elde edilse bile çalışılabilmektedir.
• Kalıp DNA üzerindeki istenilen bölgeye özgü ileri ve geri yönlü bir çift primer kullanılmaktadır. Primerler yükseltgenilmesi istenilen diziye komplementer, yapay olarak sentezletilen, 15-30 bazlık oligonükleotit dizileridir. Birisi istenilen dizinin başlangıç kısmından (ileri yönlü), diğeri ise bitiş kısmından (geri yönlü) sınırlayacak şekilde olmalıdır. Bu primerler sentezin başlaması için kalıp görevi görürler.
• Yeni dizilerin sentezlenmesini sağlayacak DNA polimeraz enzimi gereklidir. PCR işlemi yüksek ısılar gerektirdiği için kullanılacak enzimin de ısıya dayanıklı olması gerekmektedir. Bu nedenle 90 °C’nin üstündeki sıcak su kaynaklarında yaşayan ısıya dirençli bakterilerden üretilmektedir. En bilinen ve yaygın olarak kullanılanı Thermus aquaticus’dan elde edilen Taq polimeraz enzimidir.
• Yeni bir DNA’nın sentezlenebilmesi için polimeraz enzimi tarafından primerlerin ucuna eklenecek serbest nükleotidler gereklidir. Bunlar ticari olarak ayrı ayrı ya da karışım halinde satılan adenin, guanin, sitozin ve timin dinükleotid trifosfatlarıdır (dNTP).
• Gerekli olan ısı işlemlerinin düzenli bir döngü içerisinde kısa bir sürede yapılabilmesi için bir PCR cihazı gereklidir. PCR işleminin yapılabilmesi için geliştirilen bu cihazlara termal döngü cihazı (thermocycler) da denilmektedir.
PCR’ı geliştiren Mullis, ilk denemelerinde normal polimeraz enzimi kullanmıştır ve bu yüzden de her PCR tüpüne devamlı olarak yeni polimeraz enzimi eklemek zorunda kalmıştır. Bundan birkaç yıl sonra ısıya dirençli enzimin geliştirilmesiyle bu sorun da ortadan kalkmıştır.