Tespit – Fikzasyon İşlemleri
Histopatolojik değerlendirme de yanılgılara düşmemek için dikkatli ve iyi bir tespit işleminin yapılması gerekir. Fikzasyon işlemi fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Kaynatma ile yapılan tespitin hücresel yapılar üzerine yıkıcı etkisi olmasından dolayı günümüzde pek kullanılmamaktadır. Veteriner patolojide zorunlu hallerde kuduz gibi zoonoz hastalıkların hızlı tanısında bu tip tespitten yararlanılmaktadır. Kurutma ile tespit, kan ve kemik iliği yaymalarında kullanılır. Dondurma ile tespit, çözünür maddelerin (lipid, enzim) kaybını, hücresel yapıların yer değiştirmesini, kimyasal değişiklikleri, protein yıkımlanmasını en aza indirir. Diğer taraftan dondurma ile tespit, hücresel yapıların histolojik değerlendirmesi çok düzgün olmamakla birlikte hızlı tanıda kullanılır. Kimyasal tespit ise en çok kullanılan yöntemdir. Bu yöntemle alınan örnekler doğrudan tespit solüsyonuna atılır ya da hayvan anestezi altında iken organı besleyen atardamar yıkanır ve basınçla verilerek yapılır. Kimyasal tespit solüsyonları; 1.Aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, glioksal) 2.Okside Ediciler (osmium tetroksit, potasyum permanganat, potasyum dikromat) 3.Protein Yıkımlayanlar ve Pıhtılaştıranlar (asetik asit, metil alkol, etil alkol) 4.Diğer Çapraz Bağ Oluşturanlar (karbodiimidler) 5.Diğer (civa klorid, pikrik asit, aldehit içermeyenler) olmak üzere sınıflandırılırlar.BİLGİ: Zoonoz hastalıklar: Hayvanlardan insanlara geçen hastalıkların tümüne verilen genel addır.Histopatolojide tespit özel bir öneme sahiptir. Ancak hemen eklemek gerekir ki, başarılı bir tespit işleminden sonra bunu izleyen aşamalarda aynı özen gösterilmezse iyi bir sonuca ulaşılamaz. Tespitte uygun koşullar çeşitli faktörlere bağlıdır. Bunlar;Tespit Solüsyonunun Amaca Göre SeçimiBütün dokular ya da hücreler için ideal bir tespit solüsyonu hemen hemen yoktur. Söz gelimi sinir dokusu için nötral buffer formalin idealdir, ancak karbonhidrat ve proteinleri göstermek için ise etil alkol seçilmelidir. Doku ve hücrelerin canlı hayattaki yapılarına en uygun şekilde tespit birinci derecede osmium tetroksit ikinci derecede de ise formalinle olduğunu unutmamak gerekir. Bu iki tespit solüsyonunun proteinlerin yapısını bozmadan çok az bir çökelmeye neden olması iyi bir koruyucu nitelik taşıdığının göstergesidir.Tespit Solüsyonunun MiktarıTespit solüsyonu ile bu solüsyon içerisine konulacak doku örneğinin oranı önemlidir. Bir tespit solüsyonuna gereğinden fazla örnek konursa solüsyon içerisindeki kimyasallar yetersiz kalır ve uygun bir tespit oluşmaz. Bunun için 1:50 -1:100 oranı bildirilmektedir, ancak 1:15-1:25 oranı ile de uygun sonuç alınabileceğini belirtmek gerekir. Buna uymayan osmium tetroksitin %1-2’lik solüsyonu için oran 1:5’dir.Tespit Solüsyonunun pH’sıGenellikle hücre çekirdek ve sitoplazması birbirine zıt pH değerlerinde iyi sonuç verir. pH asit olduğunda çekirdek sitoplazmaya göre, alkali olduğunda ise sitoplazma çekirdeğe göre daha iyi korunur.Tespit SüresiDoku örneklerinin tespit solüsyonu içerisinde bulundurulma süresini etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunlar 1. Örneğin Büyüklüğü: Uygun büyüklükte alınan örnekler her taraftan tespit solüsyonuyla karşı karşıya olduğundan tespit solüsyonu doku örneğinin en derin kısımlarına bile otoliz şekillenmeden ulaşabilir. 2. Tespit Solüsyonunun Derine İnme (difüzyon) Gücü: Tespit solüsyonlarının difüzyon gücü çeşitlidir. Osmik ve pikrik asitler çok yavaş yayılma gösterir. Buna karşın trikloroasetik asit, formalin ve asetik asit ise oldukça hızlı bir biçimde derinliğine etkilidir. Örneğin karaciğer örneklerinde % 1’lik osmium tetroksit 4 saat içinde 0.5-1 mm derinliğe etkilerken % 10’luk formalin solüsyonu aynı sürede 4-5 mm derinliğe ulaşır. Tespit solüsyonunun difüzyon gücü sadece solüsyona değil tespit edilen organ ve doku örneğinin yapısal ve fonksiyonel özelliğine de bağlıdır. Örneğin bağdokusal membranlar tespit solüsyonunun etkisinin derinlere yayılmasını engeller. 3. Ortamın Isısı: Ortam ısısı düşük olduğunda tespit gecikir. Bu gecikme düşük ısıda difüzyon gücünün zayıflamasına bağlıdır. Histokimyasal amaçlı çalışmalarda 0-4°C derece seçilirken bunun dışında genellikle oda ısısında (20°C) çalışmak çok daha yaygın bir uygulamadır. 4. Amaç: Sürenin belirlenmesinde amaç önemlidir. Hızlı tanı için örneği asetonda olabildiğince kısa süre tutmak söz konusu iken örneğin sinir dokunun nötral buffer formalinde daha uzun süre tutmak çok daha iyi sonuç verir. 5. Doku Örneğinin Yapısı: Embriyonal dokular ve yumuşak dokular daha kısa sürede tespit edilirken sert dokular ya da organ kapsülleri daha uzun bir süre gerektirir. Tespit süresi uzadığında ise doku örnekleri parçalanır ve kötü boyanır. Doku örneklerinin uzun süre saklanmaları için formalin en uygun tespit solüsyonudur.
